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不同采收期的附子中三種烏頭堿的含量比較
不同采收期的附子中三種烏頭堿的含量比較【摘要】 目的 考察不同采收時(shí)間的附子中新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量。方法 采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相A:乙腈-四氫呋喃（25:15）；流動(dòng)相B:0.1mol/L醋酸銨溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=235nm;流速：1ml/min;柱溫：25℃。結(jié)果 不同采收時(shí)期附子中三種烏頭堿的含量發(fā)生了明顯變化，隨著時(shí)間（7 —— 9月份）的推移，新烏頭堿的含量呈下降趨勢(shì)，次烏頭堿、烏頭堿的含量呈上升趨勢(shì)。結(jié)論 此方法簡(jiǎn)單、易行，可為附子的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 附子；新烏頭堿；次烏頭堿；烏頭堿；高效液相色譜法
[Abstract] Objective To study the content mensuration of Hypaconitine,Mesaconitin and Aconitine of Aconite root in different period of harvest.Methods The Diamonsil C18 column （150mm×4.6mm,5μm） was used,and mobile phase was composed of CH3CN - C4H8O （25:15）and 0.1 mol/L of ammonium acetate solution,detection wavelength was at 235 nm; the flow rate was 1.0ml/min;column temperature was at 25℃。Results The content mensuration of three types of aconitine of aconite root in different period of harvest has chenged apparently,the content of hypaconitine appears to be decline tendency,instead,the content of mesaconitin and aconitine is ascent tendency from July to September.Conclusion This method is not only easy but also practical,it could be the evidence of further research of aconite root.
[Key words] Aconite root; Hypaconitine;Mesaconitin;Aconitine;HPLC
附子具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛之功效，為回陽(yáng)救逆之要藥[1].常用于大汗亡陽(yáng)，吐瀉厥逆，肢冷脈微，心腹冷痛，風(fēng)寒濕痹，陽(yáng)痿，宮冷，陽(yáng)虛外感，陰疽瘡瘍以及一切沉寒痼冷之疾。現(xiàn)代研究表明，附子的主要化學(xué)成分除烏頭類生物堿外，還有醇胺、脂類及多糖等。烏頭堿是附子的有效成分同時(shí)也是毒性成分[2].為保證用藥的安全有效，本文以附子為對(duì)象，以新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量為指標(biāo)進(jìn)行研究，比較不同采收期三種生物堿的含量差異。進(jìn)而為附子質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用提供借鑒。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Aglient 1100高效液相色譜儀（自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵，DAD檢測(cè)器），HP1100/ WIND3D化學(xué)工作站；超聲波清洗機(jī)（北京創(chuàng)新德超聲電子研究所）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。
1.2 試藥
新烏頭堿（批號(hào)：110799-200404,供含量測(cè)定用），次烏頭堿（批號(hào)：110798-200404,供含量測(cè)定用），烏頭堿（批號(hào)：0720-9807,供含量測(cè)定用），均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純；水為樂(lè)百氏純凈水；其他試劑均為分析純。
1.3 藥材
附子藥材均采自貴州龍里，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系賀祝英教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichahli Debx.的子根。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱為Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相A:乙腈-四氫呋喃（25:15）；流動(dòng)相B:0.1mol/l醋酸銨溶液；洗脫程序見(jiàn)表1;檢測(cè)波長(zhǎng)：λ=235nm;流速：1ml/min;柱溫：25℃；進(jìn)樣量10μl[3].表1 洗脫程序
2.2 溶液的制備
2.2.1 對(duì)照品溶液的制備
取新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿對(duì)照品適量，置25ml容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液制成濃度為（新烏頭堿0.2820mg/ml,次烏頭堿0.2817mg/ml,烏頭堿0.0802mg/ml）的混合對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備
取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3ml,精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液50ml,稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得[3].
2.2.3 陰性樣品溶液的制備
按上述供試品溶液的制備方法，制備不含附子的陰性樣品溶液。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及其陰性溶液各10μl,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果：陰性樣品在新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿峰位置對(duì)應(yīng)處無(wú)干擾峰出現(xiàn)。樣品中三種烏頭堿與其他成分完全分離，且分離度大于1.5.見(jiàn)圖1.A陰性對(duì)照品；B混合對(duì)照品；C樣品；1新烏頭堿；2次烏頭堿；3烏頭堿圖1 三種溶液高效液色譜圖
2.4 線性關(guān)系考察
精密吸取混合對(duì)照品2、4、8、10、16、18μl,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得新烏頭堿回歸方程為：Y=1225.9X+39.463,R2=0.9989;在0.56——5.08μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。次烏頭堿回歸方程為Y=1301.5X+18.581,R2=0.9996;在0.56——5.07μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。烏頭堿回歸方程為1011.4X+46.369,R2=0.9989;在0.08——1.44μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
2.5 精密度試驗(yàn)
取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液10μl,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次。新烏頭堿峰面積的RSD=0.51%;次烏頭堿峰面積的RSD=0.76%;烏頭堿峰面積的RSD=1.71%.結(jié)果表明，儀器精密度良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣，記錄其峰面積。新烏頭堿峰面積的RSD=1.55%,次烏頭堿峰面積的RSD=1.08%,烏頭堿峰面積的RSD=2.95%,結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2.7 重復(fù)性試驗(yàn)
按“2.3”項(xiàng)下的方法，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算含量。新烏頭堿含量的RSD=2.05%,次烏頭堿含量的RSD=1.34%,烏頭堿含量的RSD=2.98%.結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。
2.8 加樣回收試驗(yàn)
稱取同一附子樣品1.00g（精密稱定），共9份。分別按高中低三個(gè)量加入新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下的方法，制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿的平均回收率分別為98.61%、97.52%、97.41% ;RSD分別為1.71%,1.64%、1.89%.
2.9 樣品含量測(cè)定
精密稱取不同采收時(shí)間的附子樣品，按供試品溶液制備方法分別制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2.表2 附子樣品含量測(cè)定
3 結(jié)果
分析測(cè)定結(jié)果表明，同一采收時(shí)間的附子中次烏頭堿的含量最高，新烏頭堿次之，烏頭堿最低；不同采收時(shí)間的附子，隨著時(shí)間（7 —— 9月份）的推移，新烏頭堿的含量呈下降趨勢(shì)，次烏頭堿、烏頭堿的含量呈上升趨勢(shì)；三種生物堿的含量之和隨采收時(shí)間呈上升趨勢(shì)。然而不能單憑含量來(lái)確定附子的最佳采收期，因?yàn)楦阶拥挠行С煞智∈瞧涠拘猿煞郑玫妹羁删热擞谖ｋy，反之可害人于頃刻之間。為了科學(xué)合理地采收和利用附子資源，確保臨床用藥的安全有效，還應(yīng)與附子的毒性及臨床療效結(jié)合起來(lái)，綜合分析，方能全面系統(tǒng)地評(píng)價(jià)“最有用亦最難用”的中藥附子，本實(shí)驗(yàn)可為附子的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。
【參考文獻(xiàn)】
1 黃兆勝。中藥學(xué)。北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:225.
2 張智琳。淺析四逆湯類方治療心力衰竭的特點(diǎn)。 中華中醫(yī)藥雜志，2005,2（4）：225-227.
3 國(guó)家藥典委員會(huì)。中國(guó)藥典，Ⅰ部。北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:178.
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